基因甲基化(huà)在女(nǚ)性腫瘤檢測的(de)應用(yòng)

最近(jìn)研究，癌變過程中發生(sh λ ēng)的(de)最典型的(de)表觀遺傳修飾是(sh₹‌Ω↕ì)抑癌基因啓動子(zǐ)區(qū)域C ←pG島的(de)甲基化(huà)，調控該基因的(de₩ ≈)表達量，若高(gāo)度甲基化(huà)，基因甚至會(huì)↓↕φ沉默不(bù)表達，等效于基因發生(shēng)突變或缺失而失活，這(±♥'zhè)也(yě)有(yǒu)專家(jiā)提出抑癌基因甲基$₽↑化(huà)參與腫瘤發生(shēng)的(de)二次打擊∏≥×。近(jìn)年(nián)來(lái)，CFD∞♦€A也(yě)批準了(le)若幹個(gè)癌症的(de)基因甲基化(✔∏€ huà)産品，包括腸癌、肺癌等，直至2022年(niáδ‌↕n)8月(yuè)，國(guó)家(jiā)藥監局才發出宮頸癌甲基化(♣₩δhuà)相(xiàng)關的(de)第一(yī)張注冊證。 €接下(xià)來(lái)我們討(tǎo)論DNA甲基化(huà)∑ ♠λ作(zuò)為(wèi)女(nǚ)性腫瘤早期檢測标記物(wù)的(de)前‌φ↓景，及存在哪些(xiē)方面的(de)挑戰。

一(yī)、討(tǎo)論女(nǚ)性腫Ω↑Ω§瘤篩查與診斷的(de)現(xiàn)狀

女(nǚ)性主要(yào)的(de)腫瘤包↑✔↑§括乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和(hé)子(zǐ)宮內(nèi)膜癌。宮♣€↓"頸癌由于病因明(míng)确，癌症發生(shēng)發展機(jī)制(zhì)‌₩清楚，是(shì)WHO唯一(yī)推薦篩查的(de)≈δ÷惡性腫瘤，有(yǒu)著(zhe)規範的®§λ₩(de)三階梯診療模式，并且湘雅醫(yīε£ )學檢驗所推出的(de)PAX1基因甲基化(huà)檢∏→測已廣泛應用(yòng)于臨床。所以這(zhè)裡(lǐ)主要§β(yào)討(tǎo)論乳腺癌、卵巢癌和(‌≤&hé)子(zǐ)宮內(nèi)膜癌，雖然這(zhè)★×些(xiē)癌症都(dōu)存在現(xiàn)有(yǒu)₽↑的(de)篩查、診斷和(hé)治療模式，但('®dàn)發病率和(hé)死亡率都(dōu)很(hěn)高(gφγ↕"āo)，防治仍具挑戰。

乳腺癌（BC）是(shì)女(nǚ)性最常見(jiàn)的(de)癌症，每φ€‌ε8名女(nǚ)性中就(jiù)有(yǒu)1人(rén)患此病。钼δ€®φ靶X線或超聲成像進行(xíng)篩查，過度診斷是(shì)一(∑ ≤yī)個(gè)日(rì)益嚴重的(de)問(wèn)題，另外(wài)通(>≈tōng)過钼靶X光(guāng)檢查發現(xiàn)BC的€$(de)婦女(nǚ)中，隻有(yǒu)3% -13%的(de)治療效果得(de≥®∞)到(dào)改善[1]。

卵巢癌（OC）發病率低(dī)，但(dàn)在早期，婦女(nǚ)大(dà)多(™Ω× duō)無症狀或有(yǒu)些(xiē)非特異性的(₽✘ de)症狀，使診斷就(jiù)非常困難，目前↕<★₽尚無有(yǒu)效的(de)篩檢方法。陰道(dào)超聲檢查TVS是(s•πhì)一(yī)種高(gāo)靈敏度診斷方法。然而，它高(gāo)度依賴于個(λ‍¥↓gè)人(rén)的(de)專業(yè)知(zhī)識[2]。

子(zǐ)宮內(nèi)膜癌（EC）是(shì)最常見(jiàn)的(de)婦科(kē)惡性腫瘤，EC若能(∏σ↕néng)早期診斷，是(shì)可(kě)以治愈的(de)，目前沒有(y•γ←×ǒu)建議(yì)常規篩查[3]。

結合來(lái)看(kàn)，臨床亟需新的(de₽≤↓)标記物(wù)幫助解決女(nǚ)性腫瘤良惡性難£∏σ區(qū)分(fēn)、早期難發現(xiàn)、預後評估等問(wèn)題。

二、了(le)解DNA甲基化(huà)的(de)癌症标記物(wù)

許多(duō)研究顯示，甲基化(huà)特征幾乎可(kě)以在任何體(tǐ)↕<§‌液（血清/血漿、塗片、乳頭分(fēn)泌物(wù)和 (hé)陰道(dào)分(fēn)泌物(wù)等）中檢測到(dàφ× ∞o)。血樣可(kě)通(tōng)過微(wēi)創方式獲得(de)，并為(w♥↕èi)DNA甲基化(huà)分(fēn)析提供理★♦(lǐ)想的(de)樣本。循環遊離(lí)DNA在健康人(rén)血 δ↓↔液中的(de)平均濃度為(wèi)30ng/ml。如(rú)果我♠≤δ們假設一(yī)個(gè)正常細胞的(de)DNA含量為(wèi)6<←♦¥.6 pg，這(zhè)意味著(zhe)平均每毫升血±←液中有(yǒu)5000個(gè)基因組的(de)量。在癌症™→₩患者中，腫瘤DNA被死亡的(de)癌細胞釋放(f •àng)到(dào)血液中，血清中cfDNA的(de)平♣α€₩均濃度較高(gāo)，約為(wèi)180±≥← ng/ml[4]。

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血清中腫瘤特異性DNA甲基化(huà)分(f©™ēn)析具有(yǒu)許多(duō)優勢[5]：

1.靈敏度高(gāo)

cfDNA容易PCR擴增，提高(gāo)敏感度具有(y"<λ"ǒu)潛在可(kě)能(néng)性；

2.假陽性低(dī)

在一(yī)個(gè)特定基因上(shàng)獲得(de)甲基化(hεφ→≠uà)後，甲基化(huà)模式通(tōng)常在¶←‍疾病進展過程中相(xiàng)對(duì)保守；

3.陽性信号

DNA甲基化(huà)是(shì)可(kě)檢測的(de)陽性信号，‌¶ 而不(bù)是(shì)信号丢失，如(rú)染色體(tǐ)缺失；

4.穩定性高(gāo)

異常DNA甲基化(huà)具有(yǒu)∞‍↔化(huà)學和(hé)生(shēng)物(wù)學穩定性，相(x '≥iàng)對(duì)不(bù)受生(shēng)理(lǐ)狀态和(hé)樣品↑λ采集條件(jiàn)的(de)影(yǐng)響；

5.操作(zuò)性強

實時(shí)定量PCR的(de)基因特異性分(fēn)析很(hěn)容易适•> 應診斷實驗平台，并且該方法的(de)分(fēn)析靈敏度和(hé)特異度非常$δ高(gāo)。

6.設計(jì)簡單

基因啓動子(zǐ)CpG島高(gāo)甲基化(huàαφ" )的(de)選擇比可(kě)能(néng)分(fēn)散于基因的(de)遺傳改≈Ω"‌變（基因突變）具有(yǒu)優勢。

由于DNA甲基化(huà)分(fēn)析技(jì)術(shùΩ≤≈)上(shàng)的(de)困難，目前隻有(yǒ÷≈u)少(shǎo)量DNA甲基化(huà)标記，比如(rú)HOXA9基因甲€¥δ₩基化(huà)标記的(de)問(wèn)題出現(xià↕™¶n)在信噪比低(dī)，也(yě)就(jiù)是λγ×(shì)正常細胞遊離(lí)DNA非常×π®γ多(duō)而癌症特異性信号非常少(shǎ☆↕×o)。現(xiàn)在由于技(jì)術(shù)λ→的(de)突破這(zhè)已經不(bù)是(shì)問(wèn)題，可(kěπ✘)以用(yòng)dmPCR和(hé)NGS等手段來(lái)檢測。 £§✔

三、甲基化(huà)檢測技(jì)術(s™¥hù)實現(xiàn)臨床轉化(huà)的(λ>de)橋梁（B2B：Bench to Bedside）

甲基化(huà)特異性PCR (methyl- σβ★δspecific PCR, MSP)是(shì)一(yī)種相(x≤ ♦iàng)對(duì)簡單的(de)方法，定性多(duō)于定量的&∏Ω≥(de)。設計(jì)了(le)兩套靶區(qū)引物γβ"≤(wù)，一(yī)套擴增甲基化(huà)模闆，另一(yī)套₩±♦擴增亞硫酸氫鹽轉化(huà)後的(de)未甲基化(huà)模闆。☆∞與實時(shí)PCR相(xiàng)比×•£↑，一(yī)種更為(wèi)靈敏的(de)方法是(β∞shì)将數(shù)字PCR與MSP結合使用(yòng)¥×¶ε，這(zhè)種方法被稱為(wèi)digital Met✘αhyLight（dmPCR）。由于數(shù)字PCR通(tōng)常≈ 不(bù)受PCR效率差異的(de)影(yǐn¶≤g)響，并且能(néng)對(duì)DNA模闆進行Ω€€(xíng)絕對(duì)定量，因此與實時(shí)PC ∑₩R相(xiàng)比，數(shù)字PCR具有(yǒu)更>π<•好(hǎo)的(de)敏感性和(hé)特異性。

臨床檢驗的(de)特異性需要(yào)充分(f≥$$ēn)考慮癌症類型和(hé)臨床分(fēn)期。♣•♦在BC病例中，乳房(fáng)钼靶X線篩查的γλ"(de)過度診斷是(shì)一(yī)個(gè)令人(rén)擔憂∞★的(de)問(wèn)題，那(nà)麽生(shēng)物(wù)标志( "σ♦zhì)物(wù)确定預後不(bù)良的(de)癌症，并将其與預<$→∞後良好(hǎo)的(de)癌症以及良性腫‍↔瘤進行(xíng)區(qū)分(fēn)。相<®↔(xiàng)比之下(xià)，OC的(de)臨床檢驗則需檢出所有(‌₩yǒu)的(de)病理(lǐ)類型。在标記物(wù)開$<♥(kāi)發階段，組織學分(fēn)類對(duì)于解釋甲'¥€基化(huà)模式的(de)可(kě)變性是(sh÷≈$ì)重要(yào)的(de)，從(cóng)而可(kě)以統計♠Ω↑×(jì)分(fēn)層提高(gāo)性能(n×™♠éng)指标。尋找共同的(de)甲基化(huà± )模式而不(bù)是(shì)對(duì)☆↔÷∏比的(de)模式可(kě)能(néng)是(shì)"φ ÷一(yī)個(gè)更有(yǒu)效的(de)策略。

即使在最佳條件(jiàn)下(xià)↓>，也(yě)不(bù)太可(kě)能(néng)有(yǒu)單一(y✔ε ī)的(de)标記能(néng)夠滿足人(rén)群早期檢測OC的 ♣Ω★(de)高(gāo)特異性要(yào)求‍↓。可(kě)能(néng)的(de)解決方法₹≤是(shì)建立一(yī)個(gè)多(duō)因素分(fēn)析方法，γ 多(duō)個(gè)甲基化(huà)位點或甲基化(huà)與基因組标記的<×♥×(de)結合。但(dàn)這(zhè)樣的(de)組合，靈敏度和(hé✘‍™)特異性就(jiù)需根據臨床有(yǒu)所取舍，同時(¥$αshí)在開(kāi)發、測試階段都(dōu)應仔細測試，開(kāi↑≠)發難度增加。

四、總結

生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)開(kāi)發進展緩×→α慢(màn)一(yī)直是(shì)一(yī)個(gè)主要(yào)問♥€(wèn)題，其兩大(dà)挑戰是(sh• ♥λì)缺乏适當的(de)技(jì)術(shù)和&δ (hé)對(duì)疾病過程的(de)深入了(le)解。甲基化(huà)基ε♠↔因芯片和(hé)亞硫酸氫鹽測序的(de)幫©γσΩ助，我們可(kě)以找到(dào)合适的(de)分(fēn¶★$)子(zǐ)标記物(wù)，關鍵生(shēng)物(wù)标記物(wù)±™将能(néng)夠發現(xiàn)早期癌症或癌化(huà¥±≥)病變，并且能(néng)夠加深對(du±±©<ì)腫瘤/癌症發生(shēng)的(de)認識。另""λ一(yī)方面，也(yě)要(yào)有(yǒu)适應臨床的×δ ✘(de)技(jì)術(shù)能(néng)夠将生(shēng<↔)物(wù)标志(zhì)物(wù)的(de)發現(xiàn)轉化✔✘∑φ(huà)為(wèi)臨床可(kě)行(xíng)的₽ (de)癌症血液基因甲基化(huà)早篩和(hé)輔助診™ ¥斷。基因甲基化(huà)這(zhè)個(gè)領域正在↑π←進行(xíng)的(de)研究有(yǒu)可(®™πkě)能(néng)改進對(duì)所有(yǒu)主要(yào)女(nǚ)↔☆∑♣性癌症的(de)診斷和(hé)治療監測。

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