最近(jìn)研究，癌變過程中發生(shēng)的(♦ de)最典型的(de)表觀遺傳修飾是(shì)↑↕<±抑癌基因啓動子(zǐ)區(qū)域CpG島的(de)甲基化(huà)，♠∞​÷調控該基因的(de)表達量，若高(gāo)度甲基化(huà)，基因甚至會♠≤₹∞(huì)沉默不(bù)表達，等效于基因發生(shēng)突變或缺失而失活，'>©這(zhè)也(yě)有(yǒu)專家(jiā)提出抑癌基因甲基化( ♦♦huà)參與腫瘤發生(shēng)的(de)二次打擊。←✔近(jìn)年(nián)來(lái)，CFDA₹Ω✘也(yě)批準了(le)若幹個(gè)癌症的(de)基因甲基≥φ化(huà)産品，包括腸癌、肺癌等，直至2÷π022年(nián)8月(yuè)，國(guó)家(jiā)藥監局γ★ 才發出宮頸癌甲基化(huà)相(xiàng)關的(de£₽¶®)第一(yī)張注冊證。接下(xià)來(lái)我們討(tǎo)論DN¶ε±εA甲基化(huà)作(zuò)為(wèi)女(nǚ)性腫瘤早期♣₩‍ 檢測标記物(wù)的(de)前景，及存在哪些(xiē)方面的(→Ωde)挑戰。

一(yī)、討(tǎo)論女(nǚ)性腫瘤篩查與診斷的(de)現(x★→☆σiàn)狀

女(nǚ)性主要(yào)的(de)腫瘤↑ε包括乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和(hé)子(zǐ)宮內(nèi×​"♥)膜癌。宮頸癌由于病因明(míng)确，癌症發生(sh©'ēng)發展機(jī)制(zhì)清楚，是(shì)WHO≈₩唯一(yī)推薦篩查的(de)惡性腫瘤，有(yǒu)著(§σzhe)規範的(de)三階梯診療模式，并且湘雅醫(yī)學檢驗所£♣↕推出的(de)PAX1基因甲基化(huà)檢測•♦已廣泛應用(yòng)于臨床。所以這(zhè)裡(l•↕ǐ)主要(yào)討(tǎo)論乳腺癌、卵巢癌和(hé)子 ✘(zǐ)宮內(nèi)膜癌，雖然這(zhè)些(xiē)癌€<↓≠症都(dōu)存在現(xiàn)有(yǒu)的↓≤(de)篩查、診斷和(hé)治療模式，但(dàn)發病率和(hé)死≤₩亡率都(dōu)很(hěn)高(gāo)，防治仍具挑戰。

乳腺癌（BC）是(shì)女(nǚ)性最常見(jiàn)的(de)癌症©‍"，每8名女(nǚ)性中就(jiù)有(yǒu)1人(rén)患此病。钼靶X<​☆₩線或超聲成像進行(xíng)篩查，過度診$≤♠×斷是(shì)一(yī)個(gè)日(rì)益嚴重的(de)問(wèn)♦< ↓題，另外(wài)通(tōng)過钼靶X≤>≠光(guāng)檢查發現(xiàn)BC的(de)婦女(nǚ)中，隻有(yǒu>±♣)3% -13%的(de)治療效果得(de)到£₩≥‍(dào)改善[1]。

卵巢癌（OC）發病率低(dī)，但(dàn)在早期，婦女(nǚ)λσ&大(dà)多(duō)無症狀或有(yǒu)些(xiē)非特€×異性的(de)症狀，使診斷就(jiù)非常困難，目前尚無有( ✘yǒu)效的(de)篩檢方法。陰道(dào≥σ≈)超聲檢查TVS是(shì)一(yī)種高✘♣'δ(gāo)靈敏度診斷方法。然而，它高(gāo)度依賴于個(g≥☆è)人(rén)的(de)專業(yè)知(zhī)識[2]。$∞$

子(zǐ)宮內(nèi)膜癌（EC）是(shì)最常見(jiàn)的(de)婦科(k≈∏βē)惡性腫瘤，EC若能(néng)早期診斷，是(shì)可(kě)以治愈的(d"∏÷e)，目前沒有(yǒu)建議(yì)常規篩查[3]。γ$¶₩

結合來(lái)看(kàn)，臨床亟需新的(de)标記物(₩<wù)幫助解決女(nǚ)性腫瘤良惡性難區(qū)分☆'πλ(fēn)、早期難發現(xiàn)、預後評估等✔↑‍問(wèn)題。

二、了(le)解DNA甲基化(huà)的(de)癌症标記物(wù)

許多(duō)研究顯示，甲基化(huà)特征↑α♠↕幾乎可(kě)以在任何體(tǐ)液（血清/血漿λ¥、塗片、乳頭分(fēn)泌物(wù)和(hé)®δ陰道(dào)分(fēn)泌物(wù)等）中檢測到(dào↕♠↑∑)。血樣可(kě)通(tōng)過微(wēi)創方式獲得(d• ≈αe)，并為(wèi)DNA甲基化(huà)分(fēn)析提供理(lǐ)想₽☆的(de)樣本。循環遊離(lí)DNA在健康人(rén)血液中的(dφ™e)平均濃度為(wèi)30ng/ml。如(rú)果δ€我們假設一(yī)個(gè)正常細胞的(de)DNA含β<量為(wèi)6.6 pg，這(zhè)>₩ε意味著(zhe)平均每毫升血液中有(yǒu)5000個(gè)基因組的(dα™↔₹e)量。在癌症患者中，腫瘤DNA被死亡的(de)癌細胞釋放(fàng)到(dà π₽o)血液中，血清中cfDNA的(de)平均濃度φ™較高(gāo)，約為(wèi)180 ng/ml[4]。

        &nb$♦sp;       &nb&¥sp;     

血清中腫瘤特異性DNA甲基化(huà)分(fēn)析具有≠✘γ (yǒu)許多(duō)優勢[5]：

1.靈敏度高(gāo)

cfDNA容易PCR擴增，提高(gāo)敏感度具λ>εφ有(yǒu)潛在可(kě)能(néng)性；

2.假陽性低(dī)

在一(yī)個(gè)特定基因上(shàng)獲得(§€de)甲基化(huà)後，甲基化(huà)模式通(tōng)常¶π>在疾病進展過程中相(xiàng)對(duì×↑αε)保守；

3.陽性信号

DNA甲基化(huà)是(shì)可(kě)檢測的( ©de)陽性信号，而不(bù)是(shì)信号丢失，✔★'∏如(rú)染色體(tǐ)缺失；

4.穩定性高(gāo)

異常DNA甲基化(huà)具有(yǒu)化(huà↓ ±™)學和(hé)生(shēng)物(wù)學穩定性，γ♠相(xiàng)對(duì)不(bù)受生(¶≤shēng)理(lǐ)狀态和(hé)樣品采集條件(jiàn)的(<♣de)影(yǐng)響；

5.操作(zuò)性強

實時(shí)定量PCR的(de)基因特異性分(fēn)析很(hě™"Ωn)容易适應診斷實驗平台，并且該方法的(de)分(fēn)≈© π析靈敏度和(hé)特異度非常高(gāo)。

6.設計(jì)簡單

基因啓動子(zǐ)CpG島高(gāo)甲基化(huà)的(de)選擇比可(∑↓kě)能(néng)分(fēn)散于基因的(de)遺傳改變（基因突變）<→§'具有(yǒu)優勢。

由于DNA甲基化(huà)分(fēn)析技(jì)術★"(shù)上(shàng)的(de)困難，目前隻有(yǒu)少(ε♦←shǎo)量DNA甲基化(huà)标記，比如(rú§∏↔)HOXA9基因甲基化(huà)标記的(de)問(wèn)題↓β€出現(xiàn)在信噪比低(dī)，也(yě)就(ji₩↔♠×ù)是(shì)正常細胞遊離(lí)DNA非常多(π±duō)而癌症特異性信号非常少(shǎo)。>♥現(xiàn)在由于技(jì)術(shù)的(de)突破這(zhè)÷∏已經不(bù)是(shì)問(wèn)題₽Ω¥，可(kě)以用(yòng)dmPCR和(hé)NGS等手段≥₽'™來(lái)檢測。

三、甲基化(huà)檢測技(jì)術(shù)實現(xiàn)臨床轉化(huàδ↕€)的(de)橋梁（B2B：Bench to Bedside）

甲基化(huà)特異性PCR (methyl- specific PCR, ≈♦≠MSP)是(shì)一(yī)種相(xiàng∑'♦→)對(duì)簡單的(de)方法，定性多(d≥÷✘♦uō)于定量的(de)。設計(jì)了(le)兩套靶區( ★qū)引物(wù)，一(yī)套擴增甲基化(huà)模闆§Ω‌‌，另一(yī)套擴增亞硫酸氫鹽轉化(huà)後的(de✘→)未甲基化(huà)模闆。與實時(shí)PCR相(xi"✔àng)比，一(yī)種更為(wèi)靈敏的(de)方法是(shì)将↕"數(shù)字PCR與MSP結合使用(yòng)∞‍，這(zhè)種方法被稱為(wèi)digital Met‍φ§hyLight（dmPCR）。由于數(shù)字PCR通(tōng)常不(∏∞bù)受PCR效率差異的(de)影(yǐng)響，并且能(né±≤ng)對(duì)DNA模闆進行(xíng)絕對(duì)定量™•✘，因此與實時(shí)PCR相(xiàng)比，數(shù•£•)字PCR具有(yǒu)更好(hǎo)的(de)敏感性和(hé)特異性。

臨床檢驗的(de)特異性需要(yào)充分(fēn)考慮癌症類型和(hé£π)臨床分(fēn)期。在BC病例中，乳房¶≤λ(fáng)钼靶X線篩查的(de)過度診斷是(shì)一(yī§≤>)個(gè)令人(rén)擔憂的(de)問(wèn)✘®題，那(nà)麽生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù ↑∞)确定預後不(bù)良的(de)癌症，并将其與預後良好(hǎo)的(de)γ®©癌症以及良性腫瘤進行(xíng)區(qū)分£♥(fēn)。相(xiàng)比之下(xià)，OC的(de ​)臨床檢驗則需檢出所有(yǒu)的(de)病理™©£'(lǐ)類型。在标記物(wù)開(kāi)發階段，組織學分(fβγ♣ēn)類對(duì)于解釋甲基化(huà)模式的(de‍‌λ )可(kě)變性是(shì)重要(yào)的(de) δ≠，從(cóng)而可(kě)以統計(jì)分(fēn)層提 "高(gāo)性能(néng)指标。尋找共同的(de)甲基 ≠↓化(huà)模式而不(bù)是(shì)對(duì)>✘§♦比的(de)模式可(kě)能(néng)是(shì)一(yī®"&¶)個(gè)更有(yǒu)效的(de)策略。

即使在最佳條件(jiàn)下(xià)，也(yě)不(bù)太可(σ✔kě)能(néng)有(yǒu)單一(yī)的(de)标記能(•α♥≈néng)夠滿足人(rén)群早期檢測OC的(de)高(gāo)特Ωφ異性要(yào)求。可(kě)能(néng)的(d♣$ ©e)解決方法是(shì)建立一(yī)個(gè)多(duō)因素σ₹¶分(fēn)析方法，多(duō)個(gè)甲基化(huà)位點或甲基化$₹¶γ(huà)與基因組标記的(de)結合。但(dàn)這≠≤φ∏(zhè)樣的(de)組合，靈敏度和(hé)特異性就(jiù)需根據γ≠↑臨床有(yǒu)所取舍，同時(shí)在開(kāi)發、測試階段都(dōu φ§)應仔細測試，開(kāi)發難度增加。

四、總結

生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)開(kāi)發進≤•¶₩展緩慢(màn)一(yī)直是(shì)一(yī)個(gλ"✔$è)主要(yào)問(wèn)題，其兩大(dà)挑戰是(shì)缺乏适當£÷£€的(de)技(jì)術(shù)和(hé)對(duì)疾病 ↔過程的(de)深入了(le)解。甲基化(huà)基因芯片和♥↕‍(hé)亞硫酸氫鹽測序的(de)幫助，我們可(↓&kě)以找到(dào)合适的(de)分(fēn)子(zǐ)标記物">₩$(wù)，關鍵生(shēng)物(wù)标記物(wù±¶&)将能(néng)夠發現(xiàn)早期癌症或癌化(huà)病變，并且能(←$"λnéng)夠加深對(duì)腫瘤/癌症發生(shēng)的(de)認識。ε£ 另一(yī)方面，也(yě)要(yào)有(yǒu)适<×★ 應臨床的(de)技(jì)術(shù)能(néng)夠将生 ₽(shēng)物(wù)标志(zhì)物(w​₹ù)的(de)發現(xiàn)轉化(huà)為(wèi)臨床可(kě♥§"♥)行(xíng)的(de)癌症血液基因甲 ππ&基化(huà)早篩和(hé)輔助診斷。基因甲基化(huà)這(zh≈¥☆è)個(gè)領域正在進行(xíng)的(de)研究有(yǒu)可(kě)¥∑•能(néng)改進對(duì)所有(yǒ₩®✔‌u)主要(yào)女(nǚ)性癌症的(de)診斷和(hé)治療監測。

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